Mikroorganisma eksperimen yang digunakan oleh François Jacob dan Jacques Monod ialah bakteria makmal biasa, E. coli, tetapi kebanyakan konsep kawal atur asas yang ditemui oleh Jacob dan Monod menjadi asas kepada kawal atur sel dalam semua organisma.[15] Idea utama ialah protein tidak disintesis apabila ia tidak diperlukan; E. coli menjimatkan sumber dan tenaga selular dengan tidak menghasilkan tiga protein Lac apabila tiada keperluan untuk memetabolismekan laktosa seperti apabila gula lain seperti glukosa tersedia. Bahagian berikut membincangkan bagaimana E. coli mengawal gen tertentu sebagai tindak balas kepada keperluan metabolisme.

Semasa Perang Dunia II, Monod telah menguji kesan gabungan gula sebagai sumber nutrien E. coli dan B. subtilis. Monod mengikuti kajian serupa yang telah dijalankan oleh saintis lain dengan bakteria dan yis. Beliau mendapati bahawa bakteria yang tumbuh dengan dua gula berbeza sering memaparkan dua fasa pertumbuhan. Contohnya, jika glukosa dan laktosa kedua-duanya tersedia, glukosa dimetabolismekan dahulu (fasa pertumbuhan I, lihat Rajah 2) sebelum laktosa (fasa pertumbuhan II). Laktosa tidak dimetabolismekan semasa bahagian pertama lengkung pertumbuhan diauksik kerana β-galaktosidase tidak dihasilkan apabila kedua-dua glukosa dan laktosa hadir dalam medium. Monod menamakan fenomena ini sebagai "diauksi".[16]

Monod kemudian menumpukan perhatiannya pada pencetusan pembentukan β-galaktosidase yang berlaku apabila laktosa menjadi gula tunggal dalam medium kultur.[17]

Pengelasan mutan kawal atur

Satu kejayaan konsep Jacob dan Monod[18] adalah untuk mengenali perbezaan antara bahan kawal selia dan tapak di mana mereka bertindak untuk mengubah ekspresi gen. Seorang bekas tentera, Jacob menggunakan analogi pengebom yang akan melepaskan kargo mautnya apabila menerima penghantaran atau isyarat radio khas. Sistem kerja memerlukan pemancar darat dan penerima dalam kapal terbang. Sekarang, anggap pemancar lazim rosak. Sistem ini boleh berfungsi dengan memperkenalkan pemancar berfungsi kedua. Sebaliknya, katanya, pertimbangkan pengebom dengan penerima yang rosak. Tingkah laku pengebom ini tidak boleh diubah dengan pengenalan pesawat kedua yang berfungsi.

Untuk menganalisis mutan kawal atur operon lac, Jacob membangunkan sistem di mana salinan kedua gen lac (lacI dengan promoternya, dan lacZYA dengan promoter dan operator) boleh dimasukkan ke dalam satu sel. Kultur bakteria sedemikian yang diploid bagi gen lac tetapi sebaliknya normal kemudiannya diuji bagi fenotip kawal atur. Khususnya, ia ditentukan sama ada LacZ dan LacY dibuat walaupun tanpa IPTG (disebabkan penindas laktosa yang dihasilkan oleh gen mutan tidak berfungsi). Percubaan ini, di mana gen atau kelompok gen diuji secara berpasangan, dipanggil sebagai ujian pelengkap.

Ujian ini digambarkan dalam rajah (lacA ditinggalkan sebagai langkah peringkasan). Pertama, keadaan haploid tertentu ditunjukkan (iaitu sel hanya membawa satu salinan gen lac). Panel (a) menunjukkan penindasan, (b) menunjukkan cetusan oleh IPTG, dan (c) dan (d) masing-masing menunjukkan kesan mutasi kepada gen lacI atau operator. Dalam panel (e), ujian pelengkap penindas ditunjukkan. Jika satu salinan gen lac membawa mutasi dalam lacI, tetapi salinan kedua adalah jenis liar untuk lacI, fenotip yang terhasil adalah normal—tetapi lacZ dinyatakan apabila terdedah kepada IPTG selaku pencetus. Mutasi yang mempengaruhi penindas dikatakan resesif kepada jenis liar (dan jenis liar itu dominan), dan ini dijelaskan oleh fakta bahawa penindas ialah protein kecil yang boleh meresap dalam sel. Salinan lac operon bersebelahan dengan gen lacI yang rosak dimatikan secara berkesan oleh protein yang dihasilkan daripada salinan kedua lacI.

Jika eksperimen yang sama dijalankan menggunakan mutasi operator, keputusan yang berbeza diperolehi (panel (f)). Fenotip sel yang membawa satu mutan dan satu tapak operator jenis liar ialah LacZ dan LacY dihasilkan walaupun tanpa IPTG; kerana tapak operator yang rosak tidak membenarkan pengikatan penindas untuk menghalang transkripsi gen struktur. Mutasi operator adalah dominan. Apabila tapak operator di mana penindas perlu mengikat dirosakkan oleh mutasi, kehadiran tapak berfungsi kedua dalam sel yang sama tidak memberi perbezaan kepada ekspresi gen yang dikawal oleh tapak mutan.

Versi eksperimen yang lebih canggih menggunakan operon bertanda untuk membezakan antara dua salinan gen lac, dan menunjukkan bahawa gen struktur tidak dikawal ialah gen bersebelahan operator mutan (panel (g). Sebagai contoh, katakan bahawa satu salinan ditandakan dengan mutasi yang menyahaktifkan lacZ supaya ia hanya boleh menghasilkan protein LacY, manakala salinan kedua membawa mutasi yang menjejaskan lacY dan hanya boleh menghasilkan LacZ. Dalam versi ini, hanya salinan operon lac yang bersebelahan dengan pengendali mutan diekspresikan tanpa IPTG. Maka, boleh dikatakan bahawa mutasi operator adalah cis-dominan, ia dominan kepada jenis liar, tetapi hanya memberi kesan kepada salinan operon yang bersebelahan dengannya.

Penjelasan ini mengelirukan dalam pengeertian penting kerana ia bermula daripada penerangan eksperimen dan kemudian menerangkan keputusan sebagai suatu model. Namun begitu, sebenarnya, selalunya benar bahawa model yang dahulu betul, dan percubaan dibuat khusus untuk menguji model. Jacob dan Monod mula-mula membayangkan bahawa mesti ada tapak di DNA dengan sifat operator, dan kemudian mereka bentuk ujian pelengkap mereka untuk menunjukkan perihal ini.

Dominasi mutan operator juga mencadangkan prosedur untuk memilihnya secara khusus. Jika mutan kawal atur dipilih daripada kultur liar menggunakan fenil-Gal seperti yang diterangkan di atas, mutasi operator jarang berlaku berbanding mutan penindas kerana saiz sasaran adalah sangat kecil. Namun, jika ia dimulakan dengan strain yang membawa dua salinan seluruh rantau lac (iaitu lac diploid), mutasi penindas (yang masih berlaku) tidak dipulihkan kerana pelengkap oleh gen lacI jenis liar kedua memberikan jenis liar fenotip. Sebaliknya, mutasi satu salinan pengendali memberikan fenotip mutan kerana ia dominan kepada salinan kedua yang liar.

Kawal atur AMP siklik[19]

Penjelasan diauksi bergantung terhadap pencirian mutasi tambahan yang mempengaruhi gen lac selain daripada yang dijelaskan oleh model klasik. Dua gen lain, cya dan crp yang dipetakan jauh dari lac kemudiannya dikenal pasti, dan apabila ia bermutasi, ia mengakibatkan penurunan tahap ekspresi dengan kehadiran IPTG, dan juga dalam strain bakteria yang tiada penindas atau operator. Penemuan cAMP dalam E. coli membawa kepada dapatan bahawa mutan yang merosakkan gen cya tetapi bukan crp boleh dipulihkan balik kepada aktiviti penuh dengan penambahan cAMP ke dalam medium.

Gen cya mengekod adenilat siklase yang menghasilkan cAMP. Dalam mutan cya, ketiadaan cAMP menjadikan ekspresi gen lacZYA lebih sepuluh kali lebih rendah daripada biasa. Penambahan cAMP membetulkan ciri ekspresi Lac rendah bagi mutan cya. Gen kedua, crp, mengekod protein yang dipanggil protein pengaktif katabolit (CAP) atau protein reseptor cAMP (CRP).[20]

Walau bagaimanapun, enzim metabolisme laktosa dibuat dalam kuantiti yang kecil dengan kehadiran kedua-dua glukosa dan laktosa (kadang-kadang dipanggil "ungkapan bocor") oleh kerana fakta bahawa RNAP masih kadangkala boleh mengikat dan memulakan transkripsi walaupun tanpa CAP. Ungkapan bocor adalah perlu untuk membolehkan metabolisme beberapa laktosa selepas sumber glukosa dibelanjakan, tetapi sebelum ekspresi lac diaktifkan sepenuhnya.

Secara ringkasnya:

• Apabila laktosa tidak hadir, maka pengeluaran enzim Lac sangat sedikit (operator mempunyai penindas Lac yang terikat kepadanya).
• Apabila laktosa ada tetapi sumber karbon yang lebih baik (seperti glukosa) juga ada, maka sejumlah kecil enzim terhasil (penindas Lac tidak terikat kepada operator).
• Ketika glukosa tidak ada, CAP-cAMP mengikat ke tapak DNA tertentu di hulu promoter dan melakukan interaksi protein-protein langsung dengan RNAP lalu memudahkan pengikatan RNAP kepada promoter.

Kelewatan antara fasa pertumbuhan mencerminkan masa yang diperlukan untuk menghasilkan kuantiti enzim metabolisme laktosa yang mencukupi. Pertama, protein CAP kawal atur perlu dipasang pada promoter lac, mengakibatkan peningkatan dalam pengeluaran mRNA lac. Salinan mRNA lac yang lebih banyak tersedia menghasilkan pengeluaran lebih banyak salinan LacZ (β-galaktosidase) dan LacY (laktosa permease). Selepas penangguhan yang diperlukan untuk meningkatkan tahap enzim metabolisme laktosa, bakteria memasuki fasa pertumbuhan sel baru yang pesat.

Dua teka-teki penindasan katabolit adalah berkaitan cara paras cAMP digandingkan dengan kehadiran glukosa, dan kedua, persoalan keperluan bagi aspek sel. Selepas laktosa dibelah, ia sebenarnya membentuk glukosa dan galaktosa (yang mudah ditukar kepada glukosa). Dari segi metabolisme, laktosa adalah sama baiknya sebagai sumber karbon dan tenaga seperti glukosa. Tahap cAMP tidak ada kaitan dengan kepekatan glukosa intrasel tetapi dengan kadar pengangkutan glukosa, yang mempengaruhi aktiviti adenilat siklase. (Selain itu, pengangkutan glukosa juga membawa kepada perencatan langsung laktosa permease.) Berkenaan kenapa E. coli berfungsi dengan cara ini, ini hanya dapat dijawab dengan spekulasi. Semua bakteria enterik memproses glukosa, yang menunjukkan mereka kerap menjumpainya. Ada kemungkinan bahawa perbezaan kecil dalam kecekapan pengangkutan atau metabolisme glukosa berbanding laktosa menjadikannya berfaedah bagi sel mengawal operon lac dengan cara ini.[21]